Comédienne française, petite-fille du comédien Louis Seigner – doyen de la Comédie française –, Mathilde Seigner nait le 17 janvier 1968 à Paris. Sortie en 1994 des Cours Florent, elle commence sa carrière dans de petites productions et notamment auprès de sa sœur, Emmanuelle, dans le film Le Sourire de Claude Miller.
Très vite, son charisme, sa spontanéité et son jeu franc la placent sur le devant de la scène. La jeune actrice est révélée au public à 27 ans, lorsqu’elle reçoit le prix Michel-Simon pour sa prestation dans le film Rosine, de Christine Carrière. Mathilde Seigner connaît notamment un très grand succès au théâtre, où elle se sent plus proche des spectateurs. La pièce Madame Sans-Gêne marque particulièrement les esprits et lui vaut les éloges de la presse et de l’opinion. Mathilde Seigner est l'un des personnages principaux de la saga Camping, dont le premier film est sorti en 2006. En 2014, ses fans la retrouvent à l'affiche de La liste de mes envies. En 2017, elle campe Carine Roba, la maman de Boule dans le film Boule et Bill 2, aux côtés de Franc Dubosc. Cinq ans plus tard, elle rejoint le casting de Choeur de rockeurs dans le rôle d'Alex.
Le 3 janvier 2023, l'actrice annonce prendre une pause dans sa carrière au cours d'une interview avec Femme Actuelle. Elle fait son retour sur scène le 14 septembre avec sa soeur Emmanuelle Seigner dans la pièce Bungalow 21, d’Éric-Emmanuel Schmitt.
Côté vie privée, Mathilde Seigner est en couple de 1998 à 2001 avec l’humoriste Laurent Gerra. Elle a également partagé la vie de l’acteur Antoine Duléry, son partenaire de jeu dans la saga Camping. Aujourd’hui, le compagnon de Mathilde Seigner est Mathieu Petit, caméraman. Le petit Louis est né de cette union le 10 août 2007.